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    PCR儀反應體系異常狀況分析

    點擊次數:572 發布時間:2021-12-21
       PCR儀擴增可設置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)。因為被擴增的不同的DNA段其適合的退火溫度不同,通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增,從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的適合退火溫度進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增,這樣既節約時間,也節約經費。在不設置梯度的情況下亦可當做普通的PCR用。正真的梯度,是每一排管都有準確的加熱控溫探頭。其他的都是從兩頭的熱傳遞來設計控溫,它多應用于科研、教學機構。
      PCR儀的反應體系出現異常狀況時的分析:
      一、非特異性擴增產物的出現
      當擴增產物不止一種時,通常與以下幾種情況有關:
      1.背景DNA與引物同源性高,可通過在兩個引物的內側序列上再使用另一對擴增產物DNA再次進行PCR擴增;
      2.退火溫度太低,引物和模板的配對是一個動態過程,分子的熱運動使引物與模板結合與解離而達到佳配對位點上,退火溫度太低,造成引物與模板的非特異性位點部分配對而解離不下來,這種不正確的配對,進入PCR反應過程就可擴增出非特異性的產物DNA,提高退火的溫度將可改善結果;
      3.過量的酶,Mg2+,引物和模板DNA可使PCR反應造成混亂,強行擴增出非特異性產物DNA,適當降低這些試劑的量有助于問題的解決。
      二、無特異性擴增產物帶
      1.引物溶液反復凍融或污染了DNA酶類,造成引物降解;
      2.模板DNA制備時模板已降解;
      3.Taq酶有失活或有雜酶污染;
      4.緩沖液條件不當;
      5.引物不正確。
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